Ljudski glavni histokompatibilni kompleks (MHC) proteini su kodirani HLA (humani leukocitni antigen) sustavom. Ljudski imunološki sustav reguliran je ovim glikoproteinima koji su dio stanične membrane. MHC je podijeljen u dvije klase: MHC klasa I i MHC klasa II. Kompleks gena HLA nalazi se na kromosomu 6p21 u regiji od 3,6 Mb. S više od 10 000 različitih HLA alela identificiranih do danas, oni su najpolimorfnija obitelj gena u ljudskom genomu. Kao rezultat toga, sposobnost sastavljanja imunološkog odgovora može značajno varirati između pojedinaca unutar kohorte izvučene iz jedne populacije. Odbacivanje transplantata, autoimuna bolest, farmakogenomika cjepiva, rak, zarazne bolesti i odabir partnera povezani su s HLA genima.
Genotipizacija HLA je postupak određivanja individualnih polimorfizama gena HLA klase I i klase II, koji je potreban za podudarnost transplantata i istraživanje povezanosti bolesti. Zbog visokog polimorfizma u različitim genomskim regijama, nedvosmislena HLA genotipizacija tehnički je izazovna. Uvođenje sekvenciranja sljedeće generacije (NGS) promijenilo je krajolik genotipizacije. Tradicionalna HLA genotipizacija i Sanger testovi sekvenciranja imaju ograničenja, a HLA genotipizacija visoke rezolucije koja koristi PCR i NGS može jasno prepoznati ta ograničenja kod pacijenata. Omogućuje pouzdanu, jednostavnu, visokokvalitetnu i propusnu analizu ključnih HLA gena, s podacima raspoređenim na najmanje šest znamenki. Još jedna prednost je to što je DNK okvir sastavljen od pojedinačnih molekula, problem faziranja je riješen.
Svrha HLA tipizacije
HLA tipizacija se najčešće koristi kako bi se saznalo koji će ljudi moći dati donacije tkiva koje omogućuju najsigurnije transplantacije (presađivanje čvrstog organa ili hematopoetskih matičnih stanica).
HLA tipizacija se provodi na svim potencijalnim primateljima i darivateljima tkiva, uključujući i rodbinu transplantiranog koji žele donirati.
Volonteri također mogu uključiti HLA tip u registar koštane srži za transplantaciju matičnih stanica. Test se također radi na terminalno bolesnim ili nedavno umrlim osobama koje su donori organa.
Najbolji mogući darivatelji imaju HLA koje se blisko podudaraju s HLA obrascima primatelja. To povećava vjerojatnost da će transplantacija biti uspješna. Dobro podudaranje također smanjuje rizik od komplikacija nakon transplantacije, kao što je odbacivanje organa.
Neki ljudi također moraju imati komponentu HLA tipizacije nakon transplantacije kako bi vidjeli stvara li njihovo tijelo antitijela (“napadačke” proteine) na transplantirano tkivo. Ovo može biti znak odbacivanja organa i znači da transplantacija možda neće uspjeti.
HLA tipizacija za transplantacije
HLA tipizacija se najčešće koristi za transplantacije. Vrste transplantacija koje zahtijevaju HLA tipizaciju uključuju:
- Transplantacija matičnih stanica: Neke vrste raka krvi i genetski poremećaji krvi liječe se transplantacijom matičnih stanica iz koštane srži ili periferne krvi. Na primjer, bolest srpastih stanica može se izliječiti transplantacijom matičnih stanica.
- Transplantacije čvrstih organa: Transplantacija čvrstih organa može biti potrebna ako je neki bitan organ ozbiljno oštećen. Trauma, infekcija, autoimuna bolest, genetske bolesti, toksini i drugi uzroci mogu dovesti do toga da osoba treba transplantaciju organa.
Druge vrste HLA testiranja
Testiranje HLA gena i antigena ponekad se koristi u druge svrhe. Specifične razlike HLA gena povezane su s određenim autoimunim stanjima, bolestima i osjetljivošću na lijekove.
Na primjer, antigen HLA-B27 čest je u različitim vrstama spondiloartritisa, uključujući:
- Ankilozantni spondilitis
- Artritis povezan s Crohnovom bolešću ili ulceroznim kolitisom
- Psorijatični artritis (artritis povezan s psorijazom)
- Reaktivni artritis
- Sakroiliitis (artritis u sakroilijačnom zglobu)
- Uveitis (upala u oku)
Ostali HLA antigeni povezani su s celijakijom (HLA-DQ2 i HLA-DQ8) i narkolepsijom (HLA-DQB*06:02).
Tipovi HLA također su povezani s preosjetljivošću na lijekove. Na primjer, HLA-B57:01 i HLA-B15:02 povezani su s reakcijama na Ziagen (abakavir) odnosno Tegretol (karbamazepin).
Detekcija HLA protutijela i njezina primjena
Protutijela na HLA otkrivena su u oko 20% višerotkinja i 30% do 50% pacijentica koje su primile višestruku transfuziju. Tradicionalna serološka citotoksična metoda, protočna citometrija i metoda čvrste faze tri su primarna pristupa za otkrivanje HLA protutijela.
Metoda serološke citotoksičnosti
Magnetska zrnca se koriste za izdvajanje B limfocita iz krvi ili slezene za HLA tipizaciju klase II. HLA klasa I tipizacija može se učiniti s preostalim leukocitima. Limfociti se zatim stavljaju u pojedinačne jažice na Terasaki pločama, koje se sastoje od različitih specifičnih antitijela. Stanice u toj jažici će umrijeti ako se specifično antitijelo i HLA antigen vežu. Ova metoda ne može razlikovati HLA i ne-HLA citotoksična protutijela.
Protočna citometrija
Svježe nukleirani leukociti pomiješani su s fluorescentno obilježenim monoklonskim protutijelima u ovom eksperimentu. Površinski HLA antigeni koji se vežu na antitijela fluoresciraju, omogućujući protočnim citometrima da ih otkriju dok prolaze kroz lasersku zraku.
Tehnika čvrste faze
Reakcija se uspostavlja korištenjem PE-konjugiranih FC-specifičnih antitijela nakon što se polistirenska zrnca obojena fluorokromom obložena određenim HLA antigenima kultiviraju sa serumom pacijenta. Iako je ova tehnika delikatnija od serološke citotoksičnosti i ELISA-e, terapijski učinak povećane osjetljivosti tek treba utvrditi.
Detekcija HLA polimorfizma i njegov tijek rada
Metode koje se temelje na DNK dominiraju u laboratorijima za tipizaciju otkako je napredovala lančana reakcija polimerazom (PCR), zahvaljujući svojoj preciznosti i ponovljivosti, kao i povećanoj osjetljivosti i razlučivosti. Prajmeri specifični za PCR sekvencu (SSP), oligonukleotid specifičan za sekvencu PCR (SSO), PCR u stvarnom vremenu, tipizacija temeljena na sekvenciranju (SBT) i sekvenciranje sljedeće generacije (NGS) sve su metode koje se temelje na DNK.
Zbog svoje točnosti, velike propusnosti i brzine, NGS, također poznat kao visokopropusno sekvenciranje, postupno postaje preferirana metoda za HLA tipizaciju. Najznačajnija prednost NGS-a je ta što eliminira dvosmislenosti po cijeni usporedivoj s SBT-om i bez potrebe za dodatnim probirima, priprema DNK biblioteke, ciljano pojačanje gena koji kodiraju HLA peptide korištenjem emulzije ili PCR-a na čvrstoj fazi, tipizacija temeljena na sekvenciranju DNK , i usklađivanje sekvenci prema bazama podataka banaka gena, kao što je međunarodni projekt ImMunoGeneTics/baza podataka humanog leukocitnog antigena (IMGT/HLA), dio su NGS procesa. HLA tipizacija koja se temelji na sekvencioniranju visoke propusnosti obično se koristi u kliničkoj dijagnozi, liječenju i personaliziranoj medicini.
Za one koji žele znati više, pogledajte u reference. Tema je neiscrpna i gore sam pokušao izvući samo ono osnovno.
Reference:
https://www.intechopen.com/chapters/1128877
https://www.sciencedirect.com/topics/biochemistry-genetics-and-molecular-biology/hla-typing
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1119473/
https://www.cd-genomics.com/hla-typing-introduction-methods-and-applications.html
https://cytologicsbio.com/what-is-hla-typing-and-how-is-it-performed/
https://www.verywellhealth.com/hla-typing-overview-4588231
https://www.dkms.org/donor-info/search-for-a-match/what-is-human-leukocyte-antigen-hla-typing
Slika preuzeta sa https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2018.00503/full
